hrp辣根过氧化物酶(辣根过氧化物酶)
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1、测酶活性的实验: .用萃取化学公司法(Amano法的改进型)测定葡萄糖氧化酶 (1)试剂 ① 磷酸盐缓冲液(pH7.0):取6.805g磷酸二氢钾(KH2PO4; Merck, Art.4873)溶于350mL蒸馏水中。
2、用1M氢氧化钠溶液(NaOH (4g溶于100ml水))将pH值调至7.0,用蒸馏水定容至500mL。
3、 ② 邻-联二茴香胺(o-Dianisidine)溶液:取1.7mg邻-联二茴香胺(C14H16N2O2; Serva, Nr,19175)溶于25ml磷酸盐缓冲液。
4、 ③ 过氧化物酶(辣根过氧化酶,181U/mg)溶液(约0℃):取1.7mg过氧化物酶(Serva, Nr,31943)溶于5ml蒸馏水。
5、每毫升此溶液中应含有60个红紫倍精单位。
6、 ④ 底物溶液(约0.55M):取5.0gβ-D-葡萄糖(C6H12O6; Sigma, No.G-5250)溶于蒸馏水中,定容至50mL。
7、 使用前,至少得将此酶静置3h。
8、 ⑤ 酶(待测的葡萄糖氧化酶)溶液:用磷酸盐缓冲液溶解该酶。
9、1mL配制的酶溶液中应含有大约0.1U。
10、 0.0037g溶于500μl PBS, 再取10μl前者溶液定容至100PBS(约0.1U/ml)。
11、 测酶活性(118U/mg)的实验2 (1)操作步骤:将0.50mLβ-D-葡萄糖溶液、0.10mL在冰水中冷却过的过氧化物酶(辣根过氧化酶)溶液和2.4mL邻-联二茴香胺溶液滴入一只小烧杯内混合,调温至25℃,然后将其全部加到1cm的比色皿内,最后加0.1ml酶于待测的葡萄糖氧化酶溶液,同时按动秒表。
12、在连续15min内每隔1min于436nm处测一次吸光度 (2)计算:用以下公式计算活性: 式中:E436――每分钟吸光度的变化(436nm处)(15次的平均值) Ew――0.1ml所用酶液中含酶的重量(0.000074mg) 8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度(436nm处) 3.1――反应混合物的总体积 U1=53.25U/ mg; U2=93.21U/ mg; U3=13.30U/ mg 测酶活性(118U/mg)的实验5(061218) (1)操作步骤:将333μlβ-D-葡萄糖溶液、67μl在冰水中冷却过的过氧化物酶(辣根过氧化酶)溶液和1.6mL邻-联二茴香胺溶液滴入一只1cm的比色皿内,调温至25℃,最后加67μl酶于待测的葡萄糖氧化酶溶液,搅拌均匀(搅拌同时计时,共用8s,),然后重新按动秒表。
13、在连续15min内每隔1min于436nm处测一次吸光度 (2)计算:用以下公式计算活性: 式中:E436――每分钟吸光度的变化(436nm处)(15次的平均值) Ew――67μl所用酶液中含酶的重量(0.00004958mg) 8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度(436nm处) 2.067――反应混合物的总体积 GOD: 15min的平均值: U1=181.23U/mg; U2=167.36U/ mg; U3=156.11U/ mg 4min的平均值: U1=156.56U/ mg; U2=129.89U/ mg, U3=134.97U/ mg。
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